CD71与HbF染色法分选胎儿有核红细胞的价值

　　由于孕妇外周血中胎儿细胞的含量极少，Hahn，Holzgreve^[1]和Bianchi等^[2]报道，孕妇每毫升外周血中仅有1～2个完整胎儿细胞。所以采用特异性单克隆抗体对胎儿细胞进行标记，并结合流式细胞仪进行高效富集分选的技术，是分离、纯化孕妇外周血中胎儿细胞的最佳手段^[3]。但因目前尚未发现识别胎儿细胞的特异性抗体，故不同学者选用的标记性抗体也有所不同。本研究采用荧光激活细胞分离技术(fluorescence-activated cell sorting,FACS)，通过对孕妇外周血及未孕妇女外周血中转铁蛋白受体(transferrin receptor,CD₇₁)单标记染色和胎儿血红蛋白(fetal haemoglobin,HbF)单标记染色与双标记染色情况的比较，探讨CD₇₁与HbF染色法分选胎儿有核红细胞的价值。

　　一、资料与方法

　　1.研究对象及纳入标准：随机选择2003年10月至2004年4月在暨南大学第二临床医学院行产前检查的健康妊娠妇女92例为妊娠组(孕10～35周，年龄20～35岁，无贫血等妊娠合并症或并发症)，选择同期来我院正常身检查查、年龄20～35岁、无孕产史的健康妇女15例为未妊娠组，取两组妇女肘静脉血10ml;随机选择妊娠20～30周、脐带穿刺取血行产前诊断的l5例孕妇为脐血组，取胎儿脐静脉血3ml。3组血标本行抗凝处理，室温放置，24h内进行标记处理。

　　2.方法：(1)密度梯度离心：将血标本用不含ca²⁺、Mg²⁺的磷酸盐缓冲液按l：1的比例稀释，将每6ml稀释过的血标本缓慢加入 ml淋巴细胞分离液(美国Sigma公司产品)中，2000r/min离心20min，分离出单核细胞。(2)免疫荧光染色：将第一步得到的单核细胞用含1%小牛血清的磷酸盐缓冲液洗涤两遍，按l×105/µl的浓度，加入磷脂酸乙醇胺(phycoerythrin，PE)标记CD₇₁单克隆抗体(英国Serotec生物公司产品，为鼠抗人IgG)，室温避光孵育30min，磷酸盐缓冲液洗涤两遍，加入1 ml 1%多聚甲醛溶液固定30min，洗涤1遍。加入细胞膜打孔剂l00µl，打孔20min，并按1×106/10µl的浓度加入异硫氰酸(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的HbF单克隆抗体(美国IQ生物公司产品)染色30min，洗涤1遍，上机分选。同时设对照，分别加入鼠抗人IgGl-PE和IgGl-FITC(美国Santa Cruz生物公司产品)，操作步骤同前，排除非特异性结合。(3)FACS分选：使用型号为EPICS Altra的流式细胞仪(美国贝克曼库尔特公司产品)，根据细胞大小、颗粒及荧光强度等参数分选标记的阳性细胞。回收阳性细胞制成滴片、涂片，经荧光显微镜观察，并经Kleibaur-Giemsa染色后置于普通显微镜下观察。

　　3.统计学方法：采用t检验。

　　二、结果

　　1.CD₇₁单标记染色结果比较：妊娠组、未妊娠组和脐血组妇女CD₇₁阳性细胞百分率分别为(5.59±4.83)%、(0.14±0.05)%和(27.56±21.32)%，3组妇女相互比较，差异均有统计学意义(P<0.01)。

　　2.HbF单标记染色结果比较：妊娠组、未妊娠组和脐血组妇女HbF阳性细胞百分率分别为(4.62±3.42)%、(0.05±0.03)%和(36.85±28.64)%，3组妇女相互比较，差异均有统计学意义(P<0.01)。

　　3.CD₇₁和HbF双标记染色结果比较：妊娠组、未妊娠组和脐血组妇女CD₇₁和HbF双标记阳性细胞百分率分别为(1.28±0.84)%、(0.02±0.01)%和(10.51±8.63)%，3组妇女相互比较，差异均有统计学意义(P<0.01)。

　　4.CD₇₁或HbF单标记染色分别与双标记染色结果比较：孕妇外周血CD₇₁单标记染色的阳性细胞含量为(5.59±4.83)%，HbF单标记染色的阳性细胞含量为(4.62±3.42)%，两者比较，差异无统计学意义(P>0.05);孕妇外周血CD₇₁单标记染色和双标记染色阳性细胞含量分别为(5.59±4.83)%和(1.28±0.84)%，两者比较，差异有统计学意义(P<0.01);HbF单标记染色和双标记染色阳性细胞含量分别为(4.62 4-3.42)%和(1.28±0.84)%，两者比较，差异有统计学意义(P<0.01)。

　　5.细胞形态观察：孕妇外周血标本经CD₇₁和HbF双标记染色后，用流式细胞仪分选出的胎儿有核红细胞在显微镜下清晰可辨，形态完整。

　　三、讨论

　　由于目前产前诊断的方法在很大程度上依赖于绒毛活检、羊水穿刺、脐带血穿刺等有创性检查，所以产前诊断的普及受到限制，致使大部分唐氏综合征患儿漏诊。因此，探索从孕妇外周血中分选胎儿有核红细胞进行无创伤性产前诊断，一直是医学遗传学和生殖医学界关注的焦点之一。由于孕妇外周血中的胎儿细胞含量甚微，所以选用合适的单克隆抗体对其进行标记，并富集、分选，成为能否进行无创性产前诊断的关键。目前分离胎儿有核红细胞所用的抗原标记可分为两类：一类是阳性选择标记，即利用抗胎儿有核红细胞表面或细胞内特异性抗原的单抗，如CD₇₁、抗细胞膜磷脂糖A(glyeophorin A，GPA)、y球蛋白、抗凝血酶敏感蛋白受体(thrombospondin receptor，CD₃₆)等;另一类是阴性选择标记，即利用母体白细胞特异性抗原CD45去除母体细胞后再进行阳性选择。Bianchi等^[4]曾用CD₇₁、CD₃₆和GPA3种单克隆抗体经流式细胞仪分选胎儿有核红细胞进行胎儿性别检测，结果CD₇₁准确率为57%，CD₃₆为88%，CD₇₁或CD₃₆与GPA联合预测的准确率为100%，而单独应用GPA仍为100%，说明GPA的特异性最好。而Carolyn等^[5]的研究发现，GPA会导致分选出的细胞发生普遍凝集而影响下一步的实验。所以究竟选用哪种单克隆抗体为最好，目前国内外尚凭定论。本研究结果表明，单克隆抗体HbF与CD₇₁一样，均可用于标记孕妇外周血中的胎儿有核红细胞，且两者联合应用的双标记染色效果优于单标记染色。

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