致癌因素和癌基因在子宫颈鳞癌发病中的作用

　　摘要  目的：研究宫颈癌的分子发病机制，进一步阐明相关致癌因素和癌基因在子宫颈鳞癌发病中的作用，为治疗和预防提供依据。方法：采用PCR、ISH和IHC方法研究了51例子宫颈鳞癌组织的HPV_l6感染、HPV_l6E₆mRNA、p^21ras和C—myc蛋白表达的分布。进而阐明HPV_l6感染和p^21ras、C—myc蛋白表达对反映子宫颈鳞癌发病中的意义。结果：51例标本中HPV_l6感染38例，HPV_l6E₆mRNA阳性表达者35例，p^21ras和c—rnvc蛋白阳性表达率分别为60．8％和76．5％。结论：HPV_l6感染与p^21ras、C—myc蛋白积累无关。而p^21ras与C—myc蛋白表达则显著相关。提示癌基因活化或HPVl6感染等因素协同作用在子宫颈癌的发生发展中有重要意义。

　　关键词 子宫颈癌；人乳头瘤病毒l6型(HPV_l6)；癌基因

　　子宫颈癌的病因目前尚未明了，可能与多种因素相关，目前认为最主要的是人乳头瘤病毒(HPV)感染。在已知的70多型HPV中，至少有50％以上的子宫颈鳞癌可检出HPV_l6E₆mRNA ^[1]，表明HPV_l6在子宫颈鳞癌发病中有重要作用。已有研究发现HPVl6感染可处于潜伏状态并不表达^【2】，而HPV_l6E₆(early gene 6)mRNA更能反映HPV_l6致癌机理。子宫颈癌早已被认为是研究肿瘤各发展阶段的最好模型，然而子宫颈癌的分子发病学研究甚少。为此本组利用聚合酶链反应(Polymeras chain reac—tion，PCR)、原位杂交(In situ hybridization，ISH)和免疫组化(Immunohistochemistry，IHC)方法对51例子宫颈鳞状细胞癌中HPV_l6感染、HPV_l6E₆mRNA、p^21ras和C—myc蛋白表达及其相互关系进行研究。借以阐明它们在子宫颈鳞癌发病中的作用，为治疗和预防子宫颈癌提供依据。

　　1材料与方法

　　1．1组织标本来源

　　51例子宫颈鳞癌标本为术后存档的经福尔马林固定的石蜡包埋组织块。每个标本连续切片，厚度5扯m，分别用于HE染色、PCR、ISH和IHC。

　　1．2实验方法

　　1．2．1　聚合酶链反应：模板制备：取厚度5扯m石蜡切片脱蜡后，置200ttL消化液(0．29／L的蛋白酶K溶于50mmol／L Tris．HCL pH7．6和lmmol／LEDTA pH8．0)中，37℃水浴过夜，95℃10min后离心，上清备用。HPV_l6E₆引物l为：5’GGGAATTCC ATG CAC CAA AAG AGA ACT GCA ATG TT3’，引物2为：5’GCC GGA TCC TAA CAG CTG  GGT TTC TCT AGG TGT TCT3’。扩增片段长度为495bp。反应体系为50t-L，其中引物浓度为10pmol／L，Taq酶为2U(Promege公司产品)，模板为2．5ⅡL。反应条件为先95℃变性5min后94℃变性lmin。57℃退火lmin，72℃延伸lmin循环40次，最后72℃延伸lmin 30s。取IOt-L PCR反应产物行2％琼脂糖凝胶电泳，观察记录结果。每批实验均设阴性和阳性对照。

 

　　1．2．2　原位杂交：按质粒DNA的少量制备一碱裂解法提取HPVl6质粒DNA，采用PCR法制备地高辛标记dUTP(德国宝灵曼IBM公司)的HPV_l6—NA探针。反应体系为50t-L，其中dTrP为130ttmol／L。Di9—ll—dUTP 70tlmol／L，模板为HPV_l6质粒DNA，余同2．1。石腊切片原位杂交方法见文献^【3】，其中HPV_l6cDNA探针终浓度为4m9／L。每批标本均同时设不加探针的空白对照及PBR322阳性探针替代对照。光镜下HPV_l6E₆原位杂交阳性信号为细胞内出现蓝色颗粒。

　　1．2．3　免疫组化(SABC)：SABC法见SABC试剂盒说明书(博士德生物工程公司)，其中P2№单克隆抗体(丹麦Dak0公司)1：50，C—myc单克隆抗体(北京中山生物技术有限公司)1：100。每批均设用PBS替代抗体的阴性对照。光镜下阳性产物为棕黄色，其中着色深者为强阳性，记作“++”；着色浅者为阳性，记作“+”；不着色或隐约着色者为阴性，记作“一”。

　　1．3　统计方法

 

　　用Epilnf0 5．0Ib软件对子宫颈癌组织学分级、HPV_l6感染和IHC结果间进行t检验或Fisher精确概率检验。

　　2结果

　　经HE染色复查本组51例均为宫颈鳞癌，包括高分化(1级)6例，中分化(Ⅱ级)42例，低分化(Ⅲ级)3例。
 

　　2．1　HPV_l6E₆基因PCR检测结果51例标本经扩增后有38例可见495bp大小的HPV_l6E₆特异性条带，占74．5％。

　　2．2　子宫颈癌组织中HPV_l6E₆mRNA表达

 

　　子宫颈癌组织经原位杂交后，阳性细胞浆呈深紫蓝色或蓝色，胞核中往往也可见深蓝色颗粒。51例标本中35例为阳性，在高分化癌中，阳性细胞主要分布于癌巢之周边部；在中、低分化癌中则占据整个癌巢。

　　2．3　 HPV_l6感染和p^21ras和c—myc三种蛋白积累及其与子宫颈癌组织学分级间的相关分析

　　从表l可见，HPV_l6感染和p^21ras和c—myc蛋白积累与子宫颈癌组织学分级无统计学意义。HPV_l6感染和p^21ras和c—myc三种蛋白积累间相关关系如表2所示，HPVl6感染与后二者积累无关(P>0．05)。由表3可见P21m、c—myc二种蛋白积累间均显著相关(P<0．05)。
 

　　表l三种蛋白积累与子宫颈癌组织学分级间的关系
 

　　表2  子宫颈癌中HPV_l6感染、p^21ras和C—myc蛋白积累间的关系
 

　　表3子官颈癌中p^21ras和C—myc的关系
 

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