结直肠癌与息肉组织中CyclinA和D1阳性细胞比例的比较

　　结直肠癌与息肉组织中CyclinA和D1阳性细胞比例的比较

　　韦伟 朱立元 于志强 刘文革 贾少微 尹为华

　　结直肠癌和结直肠息肉均为细胞增生性疾病，但前者为失控性生长，后者属于限制性生长。资料表明大多数结直肠癌来自腺瘤样息肉。为探索两者增生过程中细胞周期调控机制的改变，我们对结直肠癌与息肉组织中的细胞周期素A和D1(Cy-clinA、D1)阳性细胞比例进行了检测、比较和分析。

　　材料和方法

　　1.标本来源：所有标本均取自我院2001年5月以来经常规病理诊断为乙状结肠、直肠息肉和乙状结肠、直肠癌病人的标本。结直肠息肉病人51例，平均年龄35.7岁(25～68岁)，男35例，女16例。位于乙状结肠21例，直肠30例。单个或2个息肉者39例，3个或3个以上的多发性息肉12例。病理报告腺瘤样息肉31例，炎性息肉20例，无合并结直肠癌或息肉恶变者。结直肠癌病人43例，平均年龄51.6岁(30～75岁)，男32例，女11例。位于乙状结肠19例，直肠24例。组织学分类，腺癌类肿瘤34例，其它9例。有局部淋巴结转移者38例。所有病人无肝、肺、骨等远处转移。

　　2.标本制作：将获取的结直肠息肉、结直肠癌肿和正常乙状结肠粘膜组织(对照组)标本一分为二，一半送常规病理学检查，另一半标本用机械粉碎法(冰上操作)，将其制备成单细胞悬液后，以-20℃、体积分数为70%的乙醇固定，置于-20℃冰箱保存。

　　3.CyclinA、D1阳性细胞的检测：选择病理诊断为腺瘤样息肉的31份标本和腺癌类肿瘤的34份标本进行细胞周期素的检测。检测前，将固定保存的单细胞悬液以磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次， 2.5g/LTriton X-300冰上处理5min。再次PBS洗涤后加入10g/L牛血清蛋白(BSA)稀释的鼠抗人CyclinA和CyclinD1单克隆抗体(LabVision公司)。在100μL的体积中，每5×10个细胞与0.25μg单克隆抗体反应，412孵育过夜。次日加入以10g/LBSA稀释成1：40的FITC羊抗鼠IgG抗体(Sigma公司)，室温下孵育30min。再次洗涤后，用10mg/LPI和1.0g/LRnaseA，室温下染色20min。应用FACSort流式细胞仪(美国BectonDickson公司)检测样本。经488nIn激光激发，被标记细胞发射的红色(PI)和绿色(FITC)荧光，同时且分别被流式细胞仪的标准透镜接收。以Cellquest软件(美国BectonDickson公司)，对上述所测细胞的荧光强度和任一细胞群体的平均荧光强度进行分析。

　　4.统计学方法：各组的构成比之比较经过X²检验。P值小于0.05有显著意义。

　　结果

　　对照组和各实验组CyclinA、D1阳性细胞比例的检测结果：对照组CyclinA为(2.79±0.35)%， CyclinD1为(4.10±0.52)%；腺瘤样息肉组CyclinA为(6.34±4.17)%，CyclinD1为(19.03±2.16)%；腺癌类肿瘤组CyclinA为(29.94±4.78)%；CyclinD1为(37.85±5.02)%。两实验组与对照组各检测指标相比，差异有显著性(P<0.05)。对照组两项检测值均较低，在5%以下，表明正常结肠粘膜组织中的细胞，进入细胞周期、处于增生状态的数目十分有限。在腺瘤样息肉组中，CyelinA和D1值与对照组相比有所增加，尤其是CyclinD1，其增加幅度显著大于CyclinA。显示腺瘤样息肉的增生过程中，CyclinD1所具作用较CyclinA明显。在腺癌类肿瘤组，CyclinA和D1值均发生了显著变化，分别高达(29.94±4.78)%和(37.85±5.02)%，表明CyclinA、D1对结直肠腺癌的发生发展过程，都具有一定的影响。

　　讨论

　　多数学者认为结直肠息肉是结直肠癌的癌前病变，并且直肠和乙状结肠的息肉癌变率显著高于其他结肠部位3。息肉和癌肿组织中的细胞均处于增生状态，细胞因子、生长激素、癌基因等都可以影响细胞的增生，但作用的最终汇聚点是细胞周期。在细胞周期的Gl/S和G2两个细胞转化时域，各有一细胞周期限制性检测点(Restricted Checkpoint)，其受到由细胞周期素、细胞周期素依赖性蛋白激酶(CDKs)和CDKs抑制因子(CDI)组成的调控网络的调节。CyclinD1是参与调控G1/S期限制性检测点的重要蛋白之一，在正常细胞中的功能是促进细胞由G1期向S期转化。如果CyclinD1过量表达，将影响检测点的正常功能，并使细胞G1期缩短，易导致细胞以分化不足的状态通过检测点。ber等的研究表明，CyclinD1在结直肠癌中的阳性表达率为30%～60%，在结直肠腺瘤中的阳性表达率为34%～83%。本组资料显示，CyclinD1阳性细胞比例，在结直肠腺癌组织中为(37.85±5.02)%，同相关资料一致，表明CyclinD1参与了结直肠癌的发生、发展，是结直肠癌发生的早期事件。在结直肠腺瘤样息肉组织中，本组资料显示，CyclinD1阳性细胞比例为(19.03±2.16)%，较对照组显著增加(P<0.05)，其在腺瘤样息肉细胞增生时，以及可能向腺癌发展的过程中，所起作用显而易见。CyclinA是细胞进人M期所必须的调节蛋白，其过表达将使处于G2/M期细胞的百分比增加，从而影响细胞周期的进程，促进细胞增殖。本组资料中，CyclinA阳性细胞比例在结直肠腺瘤为(6.34±4.17)%，与对照组相比，其增加幅度低于CyclinD1。可能是腺瘤样息肉细胞的限制性检测点功能尚属正常，不合格增生细胞通过检测点并进人G2/M期的细胞数量有限。也可能高CycylinD1、低CyclinA是腺瘤样息肉细胞增生的细胞周期表现类型。在结直肠腺癌，CyclinA阳性细胞比例为(29.94±4.78)%，较息肉组显著增高(P<0.05)。但是否意味着各种因素导致CyclinA的过表达，是息肉发展为腺癌的关键，尚不能下此结论。不过可以推断，腺癌细胞的限制性检测点功能遭到了破坏，癌变细胞不受限制的增生于细胞周期的各时相，CyclinDl与CyclinA阳性细胞数目同时增加，促进了结直肠癌的发生与发展。总之，由本组资料可以看出，在结直肠息肉增生和结直肠癌发生发展的过程中，都与CyclinDl的异常增高相关，而CyclinA与结直肠腺瘤增生关系不明显，其主要增加于结直肠癌组织中。细胞周期素的异常增加，使限制性检测点这一细胞周期调控的重要基础发生改变，导致细胞失控性生长，并最终发展为恶性肿瘤。

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